Tugas Terstruktur Mata Kuliah Bioanorganik

Stabilisasi Mn(II) dan Mn(III) pada Kompleks Mononuklear dengan Donor N₂O: Sintesis, Stuktur Kristal, Aktivitas Superoksiada Dismutase dan Studi Interaksinya dengan DNA

Disusun Oleh:

Jaka Purnama H1A007012

Iskandar Zulkarnain H1A007047

Feni Sumiati H1A008029

Etin Nurfebriani I H1A008030

KEMENTRIAN PENDIDIKAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS SAINS DAN TEKNIK

JURUSAN MIPA PROGRAM STUDI KIMIA

PURWOKERTO

2011

I. PENDAHULUAN

Mangan, suatu unsur penting untuk manusia yang jumlahnya melimpah di alam dan logam melimpah kedua dalam kaitannya sebagai logam transisi periode pertama. Pada kehidupan beberapa enzim seperti superoksida dismutase, oksalat oxidase, lipoksigenase (LO), katalase dan sebagainya memerlukan logam mangan sebagai kofaktor untuk aktivitas katalitik enzim-enzim tersebut. Pada reaksi biologi, mangan berperan sebagai asam lewis kadang pada sisi lain,mangan dapat berperan untuk reaksi redoks pada kedudukan oksidasi + 2, +3 dan + 4. Oleh karena itu mangan mempunyai peran yang banyak pada kehidupan. Kimia koordinasi dari mangan telah dimanfaatkan untuk modeling struktural dan fungsional dari metalloprotein. Aplikasi lain dari mangan yaitu untuk studi aktivitas katalitis dan sintesis dari kompleks logam fotolabil nitrosil. Stabilisasi dari keadaan oksidasi mangan telah mencakup toksisitas dari mangan itu sendiri. Superoksida dismutase merupakan kelas penting dari enzim redoks yaitu bertanggung-jawab untuk reaksi disproporsionasi dari ion superoksida (O₂) yang dihasilkan oleh suatu pengurangan elektron dari oksigen. Reaksi redoks diperlihatkan di bawah ini:

Ion superoksida diketahui menjadi penyebab stres oksidatif dan jenis reaktif ini bertanggung-jawab untuk beberapa penyakit seperti cedera reperfusi, artritis, neuronal apoptosis, kanker dan lain sebagainya. Metalloenzim ini dapat melakukan reaksi katalisis redoks dengan beberapa ion logam yaitu tembaga, seng, mangan, besi atau nikel. Kompleks mangan meniru aktivitas dari enzim superoksida dismutase yang digunakan untuk menghancurkan ion superoksida yang merugikan. Selain kompleks mangan dan turunannya secara luas dapat digunakan untuk meniru aktivitas SOD.

Interaksi DNA dengan kompleks logam transisi diperoleh interaksi sehingga dapat digunakan untuk aplikasi dalam penelitian kanker dan kimia asam nukleat. Meskipun cisplatin dan carboplatin sedang digunakan, ada beberapa efek samping obat kemoterapi. Di antara kompleks logam transisi lain, yaitu kompleks tembaga dan ruthenium, saat ini digunakan secara ekstensif untuk mempelajari interaksi logam kompleks dengan DNA. Pada jurnal ini telah merancang tiga ligan tridentate berisi donor phenolato tunggal bersama dengan piridin dan donor imina. Sintesis dan karakterisasi spektroskopi dari turunan ligan yang baru dan kompleks mononuklear kompleks mangan akan dijelaskan. Struktur molekul dari dua kompleks perwakilan direpresentasikan penentuannya dengan alat kristalografi sinar-X. Ditentukan juga nilai IC50 untuk kompleks ini menggunakan xanthine oksidase-xanthine-nitrobluetetrazolium (NBT) assay. Jurnal ini juga melaporkan studi interaksi turunan kompleks mangan dengan DNA dan aktivitas nukleasenya.

II. METODOLOGI PERCOBAAN

2.1 Bahan

Semua pelarut sebagai pereaksi dapat digunakan. Pemurnian dari semua pelarut dilakukan pada tekanan rendah. Toluene, dietieter, dimetilsulfooksida (DMSO), dimetilormamida (DMF), kloroform dan diklorometana dimurnikan pada penyulingan sekitar 4 Å ayakan molekular dan ayakan penyimpanan. Metanol dimurnikan dengan destilasi sekitar 3 Å ayakan molekular dan ayakan penyimpanan. Asetonitril, aseton dikeringkan dengan refluks dan penyulingan sekitar P₂O₅ (0. 5%, w / v). Bahan reaksi susun analitis salisilaldehid, o hydroxyace - tophenone, 2 - hidroksi - 1 - naptaldehid, trietilamin,Natrium perklorat dan t-buttilhidroperoksida (^tBuOOH), natrium hidrida, MnCl_2.4H₂O,Mn(CH₃COO)₂.4H₂O, Mn(ClO₄)₂.6H₂O, Mn(CH₃COO)₃.2H₂O. [Mn(DMF)₆]ClO₄)₃, Xanthine, nitro blue tetrazolium (NBT) dan katalase, xantine oxidase (XO), agarosa dan ethidium bromida (EB). supercoiled pBR322 DNA dan DNA timus anak sapi (CT DNA) dan Penyangga Tris.

2.2 Cara Kerja

2.2.1 Pengukuran fisik

Analisis unsur dilakukan secara mikroanalitika pada Elemenlar Vario EL III. Titik leleh diperoleh mempergunakan alat penentuan titik leleh. Spektra IR ditentukan menggunakan pellet KBr dengan spektrometer Thermo Nikolet Nexus FT IR menggunakan 50 pembesaran dan didapat sinyal dalam cm^-1, data GC-MS diperoleh menggunakan satu quadrupole Perkin Elemer Clarus 500 yang dipasangkan pada satu Perkin Elemer Clarus 500 GC yang disiapkan dengan sebuah detektor kolom Elit - 1 dan detektor massa dioperasikan pada 70 eV. Spektrum serapan elektronik merekam tentang bahan pelarut diklorometana, asetonitril, DMF atau DMSO dengan sebuah Evolusi 600, spektrofotometer Thermo Scientific UV–vis. Titrasi penentuan emisi dilakukan pada Varian spektrofotometer fluoresensi. ¹H dan ¹³C NMR direkam pada spektrometer Bruker AVANCE, 500. 13 MHz, penggantian kimia untuk spektrum ¹H NMR berhubungan ke standar internal Me4Si untuk seluruh residu protium pada bahan pelarut terdeutrasi. Kepekaan magnetis ditentukan pada 297K dengan Magnetometer Vibrasi model 155, menggunakan nikel sebagai standarnya. Koreksi diamagnetik dilakukan dengan kenaikan Pascal-nya. Konduktivas molar pengikatannya ditentukan dalam DMF pada 10^-3 suhu 25⁰C dengan sebuah konduktometer Systronics 304. Pengukuran voltammetri siklis di ukur menggunakan sebuah elektronalizer CHI-600C dalam diklorometana dan asetonitril. Sebuah tiga elektroda konvensional mengatur daya dari platina sebagai elektroda pelengkap, kaca karbon elektroda pekerja dan electroda Ag(s)/AgCl, digunakan sebagai elektroda referensi. Pengukuran ini dilaksanakan menggunakan 0.1 m tetrabutilammonium perklorat (TBAP) sebagai pendukung elektrolit, mempergunakan konsentrasi kompleks 10^-3 M dalam diklorometana dan asetonitril. Sepasang ferrosena / ferrosenium ditemukan dalam E_1/2 = + 0.42 (72) V vs. Ag/AgCl pada kondisi percobaan yang sama. Semua percobaan dilaksanakan dalam temperatur kamar.

2.3 Sintesis ligan

2-(1-phenylhydrazinyl)pyridine dipersiapkan sesuai dengan petunjuk referensi yang ada. PhimpH ligan (2-((2-phenyl-2-(pyridin-2- yl)hydazono)metil)zat asam karbol), N–PhimpH (2-((2- phenyl-2-(pyridin-2- yl)hydrazono)metil)napthalen-1-ol), Me–PhimpH (2-(1-(2-phenyl-2-(pyridine-2- yl)hydrazono)etil)-zat asam karbol) dipadukan dengan mereaksi 2-(1-phenylhydrazinyl)-pyridine dengan salicylaldehyde, 2-hydroxy-1- napthaldehyde dan o-hydroxyacetophenone berturut-turut dengan metanol. Rincian sintesis dideskripsikan pada Keterangan Pendukung.

2.4 Sintesis dari kompleks logam

Garam Perklorata dari kompleks logam dengan ligan organik berpotensi dapat meledak. Hanya kuantitas kecil dari senyawa ini yang disiapkan dan ditangani dengan perlindungan sesuai. Semua kompleks dipersiapkan oleh lebih dari satu prosedur. Sebuah metode dideskripsikan sini dan sisanya dideskripsikan pada Pendukung Keterangan.

2.4.1 Sintesis dari [Mn(Phimp)₂] (1)

Kompleks 1 direaksikan menggunakan tiga mangan yang berbeda (II) yang menggarami secara terpisah, keseluruhan prosedur hampir sama. Satu batch dari triethylamine (Et₃N) (133. 3 mg, 1. 32 mmol) ditambahkan ke dalam ligan (PhimpH) (381 mg, 1. 32 mmol) pada 10 mL diklorometana. Setelah diaduk selama 30 menit, satu batch dari Mn (ClO₄)₂.6H₂O (238 mg, 0. 66 mmol) pada 10 mL metanol ditambahkan scara perlahan-lahan. Setelah 3 jam pengadukan, bahan pelarut diuapkan untuk membentuk padatan oranye kemudian dicuci dengan sejumlah kecil metanol, dietileter dan dikeringkan dalam vakum. Padatan oranye membentuk kristal tampak difusi dietileter dalam diklorometana / metanol (1:1) dari kompleks selama 24 jam.

2.4.2 Sintesis dari [Mn(Phimp)₂]ClO₄) (2)

Satu batch ligan (PhimpH) (578.0 mg, 2.00 mmol) dilarutkan pada 7 mL diklorometana, metanol dan air (2.0:4.5:0.5). Setelah di aduk selama 10 menit, satu batch dari Mn (CH₃COO)₃.2H₂O (268.0 mg, 1.00 mmol) ditambahkan secara perlahan, warna dari larutan berubah menjadi warna coklat gelap. Setelah 15 menit di aduk, sodium perklorate (140.0 mg, 1.00 mmol) ditambahkan ke campuran reaksi di atas. Padatan coklat mengendap setelah 30 menit, selanjutnya di aduk selama 3 jam. Setelah 3 jam pengadukan, campuran reaksi membentuk padatan coklat gelap kemudian dicuci dengan kelebihan dari metanol dan dikeringkan dalam vakum. Warna coklat gelap menghalangi kristal bentuk tampak lambat vaporasi dari larutan kompleks 2 dalam asetonitril / dietileter (5 mL/3 tetes) setelah satu minggu pada suhu-kamar.

2.4.3 Sintesis dari [Mn(N–Phimp)₂] (3)

Satu batch NaH (7.7 mg, 0.32 mmol) ditambahkan ke larutan ligan (N–PhimpH) (101.7 mg, 0.30 mmol) dalam toluene (15 mL). Setelah di aduk selama 30 menit, satu batch Mn(ClO₄)₂.6H₂O(54.3 mg, 0.15 mmol) pada 5 mL metanol ditambahkan secara perlahan, warna larutan berubah dari menguning ke oranye. Setelah 3 jam pngadukan pada atmosfer nitrogen, campuran reaksi dikonsentrasikan menjadi 5 mL, padatan oranye terbentuk. Padatan oranye ini dicuci dengan kelebihan dari toluene dan sejumlah kecil metanol dan dikeringkan dalam vakum.

2.4.4 Sintesis dari [Mn(N–Phimp)₂]ClO₄) (4)

Satu batch dari triethylamine (Et₃N) (17.2 mg, 0.17 mmol) ditambahkan pada larutan ligan (N–PhimpH) (57.6 mg, 0.17 mmol) dalam10 mL metanol:diklorometana (1:1). Setelah di aduk selama 30 menit, satu batch Mn(ClO₄)₂.6H₂O (61.5 mg, 0.17 mmol) pada 5 mL metanol ditambahkan pelan-pelan, warna larutan berubah dari kuning ke oranye dan setelah 2–3 jam warna larutan berubah menjadi warna coklat gelap. Setelah 12 jam pengadukan, 5 mL dietileter ditambahkan pada campuran reaksi di atas, padatan coklat memisah dari larutan dan dicuci dengan sejumlah kecil metanol dan dikeringkan dalam vakum.

2.4.5 Sintesis dari [Mn(Me–Phimp)₂](ClO₄) (5)

Satu batch NaH (24.0 mg, 1. 00 mmol) ditambahkan ke dalam larutan ligan (Me–PhimpH) (303.0 mg, 1.00 mmol) dalam diklorometana (5 mL). Setelah di aduk selama 15 menit, satu batch dari [Mn(DMF)6] ClO4)3 (395.0 mg, 0.50 mmol) pada 10 mL asetonitril ditambahkan pelan-pelan; warna larutan berubah dari kuning ke warna coklat gelap. Setelah 3 jam pngadukan, 5 mL dietileter ditambahkan ke campuran reaksi di atas dan sebuah padatan coklat dipisahkan lalu dicuci dengan sejumlah kecil metanol dan dikeringkan dalam vakum.

2.5 Penentuan struktur X-ray

Menurut data X-ray dan proses untuk kompleks 1 dan 2 dibentuk pada Diffraktometer Bruker Kappa II. CCD dengan menggunakan monokromator grafit pancaran Mo-Kα (λ= 0.71070 Å) pada suhu 293 K dan 296 K. Struktur kristal dilarutkan dengan metode langsung. Data yang dihasilkan dapat dibawa keluar dengan program SHELXTL. Atom hidrogen ditempatkan pada posisi geometri dengan mempergunakan suatu model. Hasil tersebut dapat diperoleh dengan program DIAMOND.

2.6 Pengukuran aktivitas dari superoksida dismutase

Aktivitas Superoksida dismutase dari kompleks 1, 2, 4 dan 5 ditentukan oleh penggunaan metode tak langsung menggunakan uji nitro blue tetrazolium (NBT). Pada metode ini anion superoksida dihasilkan di tempat asalnya menggunakan sistem enzymetically oleh sistem xanthine / xantine oxidase dan dideteksi dengan spektrofotometri oleh reduksi dari NBT yang dihasilkan oleh sebuah formazan berwarna biru. Absorbansi pada 560 nm dapat meningkat akibat formazan yang dihasilkan. Bagaimanapun, peningkatan laju dari absorbansi berkurang dengan peningkatan dari konsentrasi kompleks. Pengujian diselesaikan menggunakan buffer fosfat (50 mM) pada pH 7.8 menggunakan xanthine 0.2 mM, 0. 12 mM NBT, 0.07 U/mL xanthine oxidase dan catalase 1000 U/mL dengan volume akhir 750 μL. Senyawa yang diuji dilarutkan dalam DMSO / DMF (untuk 1 dan 5 dalam DMSO serta kompleks 2 dan 4 di DMF) dan konsentrasi akhir dari DMSO / DMF pada campuran reaksi tersebut adalah 0.1% dalam buffer fosfat pada pH 7.8. Reaksi diawali dengan penambahan 0.07 U/mL xanthine oxidase dan pengukuran diawali setelah 15 menit dari masing-masing percobaan.

2.7 Studi pengikatan DNA oleh titrasi, spektroskopi dan percobaan

Percobaan diselesaikan dalam 0.1 M buffer fosfat pada pH 7.2 menggunakan larutan thymus DNA anak sapi (CT-DNA) pada absorbansi 260 nm dan 280 nm (A260 / A280) yang mengakibatkan CT-DNA menjadi bebas protein. Konsentrasi larutan DNA diukur dengan spektrofotometer UV–visible dengan absorbansi 260 nm. Titrasi absorbansi diselesaikan dengan sebuah kompleks 23 μM dari variasi konsentrasi CT-DNA dari 0- 68 μM.

Percobaan fluoresensi diselesaikan dengan penambahan 0-7 μM dari kompleks mangan ke larutan DNA (25 μM) yang mengandung 5 μM EB dalam 0.1 M buffer fosfat pH 7.2, sampel tersebut diukur pada 510 nm dan emisinya diamati diantara 530 dan 550 nm.

Perpecahan dari plasmid DNA dimonitori menggunakan elektroforesis gel agarosa. Super koloid pBR32 DNA (200 ng) dalam TBE pH 8.2 direaksikan dengan kompleks mangan 100 μM yang dilarutkan dalam DMF (10%) yang keberadaannya berasal dari zat additif. Oksidatif perpecahan DNA oleh kompleks dipelajari keberadaannya dari H₂O₂ (200–400 μM agen pengoksidasi) dan KI (400 μM). Sampel diinkubasi selama 1,5 jam pada 37⁰C dengan penambahan loading buffer (25% bromofenol biru dan 30% gliserol). Gel agarosa (0.8%) mengandung 0.4 μg/mL dari EB disiapkan dan dielektroforesis dari perpecahan produk DNA ditunjukkan sebelumnya. Gel dioperasikan pada 60 V selama 2 jam dalam buffer TBE dan pita DNA nya diidentifikasi dengan cara diletakkan di bawah lampu UV ilumnator. Fragmen DNA didokumentasi menggunakan BIO RAD.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Sintesis dan Karakterisasi dari Ligan dan Kompleks Logam

Ligan tridentat PhimpH, N–PhimpH dan Me–PhimpH telah disintesis dan dikarakterisasi menggunakan analisis unsur, UV–visible, IR, spektrometri GC-MS, dan spektroskopi NMR. [Mn(Phimp)₂] (1) disintesis dari reaksi deprotonasi ligan dengan mangan (II) sebagai bahan dasar. [Mn(Phimp)₂]ClO₄ (2) disiapkan dengan mangan (III) sebagai bahan dasar melalui reaksi oksidasi dari kompleks 1 oleh ^tBuOOH. [Mn(N–Phimp)₂] (3) disiapkan dengan mangan (II) sebagai bhan dasar dalam atmosfer inert. Turunan 4 dari mangan (III) disiapkan dengan reaksi deprotonasi ligan dengan [Mn(DMF)₆]ClO₄)₃. Pada faktanya, deprotonasi ligan Me–PhimpH tidak mestabilkan pusat mangan (II) dan pada semua percobaan diakhiri dengan kompleks [Mn(Me–Phimp)₂]ClO₄ (5). Prosedur pembuatan dari kompleks 1, 2, 3, 4, 5 dan konversinya telah diringkas pada Gambar 1.

Gambar 1. Pembuatan kompleks 1, 2, 3, 4, 5.

Karakteristik pita azomethine (–HC=N–) pada IR untuk ligan bebas yang diamati pada 1607–1620 cm^-1. Koordinasi dari nitrogen untuk logam pusat dengan menurunkan densitas elektron dalam separuh ke themetal memusat dikurangi kepadatan elektron pada azomethine sehingga dapat menurunkan frekuensi regang azomethine untuk ν_–HC=N pada [Mn(Phimp)₂] dan [Mn(N–Phimp)₂] dengan jelas mengindikasikan ligasi dari azomethine nitrogen ke logam pusat. ν_–HC=N untuk [Mn(Phimp)₂](ClO₄), [Mn(N–Phimp)₂](ClO₄), dan [Mn(Me–Phimp)₂](ClO₄) yaitu berturut-turut 1608, 1611 dan 1603 cm^-1. Serapan IR mendekati 1090 cm^-1 bersama-sama dengan sebuah serapan pada 623 cm^-1 yang ditemukan pada semua kompleks mangan (III). Kekurangan dari pembelahan dua pita diakibatkan oleh kehadiran ion perklorat non koordinasi ke logam pusat. Serapan dengan intesitas intensitas 1297–1324 cm^-1 pada dasar Schiff dapat diperlakukan sebagai regangan fenol C-O. Pergeseran dari ν_C–O ke frekuensi lebih tinggi mendukung deprotonasi dan formasi ikatan metal-oksigen. Selanjutnya didukung oleh penghilangan dari lebar ν_O–H pada spektrum IR dari semua kompleks logam. Pengukuran konduktivitas molar dalam DMF pada ca.10^-3 M dan ditentukan pada suhu 25 ⁰C untuk kompleks 1 dan 3 ditemukan berturut-turut 6.0 dan 8.0 Ω^-1 cm² mol^-1 sedangkan dengan pengukuran yang sama untuk kompleks 2, 4 dan 5 berturut-turut yaitu 59.0, 61.0, dan 54.0 Ω^-1 cm² mol^-1. Nilai untuk kompleks 1 dan 3 dikonfirmasi oleh perilaku elektrolit netral sedangkan nilai untuk kompleks 2, 4 dan 5 dengan jelas menunjukkan uni valensi tunggal (1:1) perilaku larutan elektrolit. Untuk kompleks 1 dan 3, pada temperatur kamar 297 K nilai momen magnetiknya berturut-turut yaitu 5.87 dan 5.49 μB, meramalkan stabilitas dari high-spin d⁵ mangan (II) pada dua kompleks di atas. Nilai momen magnetik untuk kompleks 2, 4 dan 5 berturut-turut yaitu 4.69, 4. 97 dan 4.77 μB, dimana dapat diharapkan untuk spin magnetik tinggi d⁴ ion mangan (III), menandai sedikit atau tidak adanya interaksi antiferomagnetik. Absorpsi maksimal pada 400 nm untuk kompleks 1 serta pada 430 dan 450 nm untuk kompleks 3 sebagai syarat ligan ke transfer muatan logam (LMCT) transisi. Serapan yang mendekati 420 nm berturut-turut untuk kompleks 2, 4 dan 5 sebagai syarat dari oksigen fenolato ke mangan (III).

3.2. Interkonversi

Karakteristik spektrum UV–visible dari sintesis kompleks mangan ini men untuk memonitor interkonverinya mereka (diperlihatkan di skema 2) melalui pembahasan spektrum UV–visible. Interkonversi dari kompleks 1 ke kation dari kompleks 2 diperlihatkan pada gambar 1 sedangkan interkonversi dari kompleks 3 ke kation dari kompleks 4 diperlihatkan pada gambar 2. Absorbansi mencapai puncak pada panjang gelombang 399 nm dari komplek [Mn^III (Phimp)₂]⁺ seperti terlihat pada gambar 1. Penyusutan pada intensitas dari puncak pada 429 nm dan 448 nm dan bertambah pada intensitas dari puncak pada 384 nm pada gambar 2 menandai pembentukan kation kompleks 4 dari kompleks 3. Waktu perencanaan (ada pada gambar 2a dan 2b) dengan jelas memperlihatkan laju yang lebih tinggi dari konversi dengan oksidasi produk dari ^tBuOOH dibandingkan dengan konversi dari oksigen. Oleh karena itu kompleks 2 dan 4 dapat direaksikan menggunakan reaksi oksidasi dari kompleks 1 dan 3. Karakterisasi dari kompleks 2 dan 4 yang diperoleh dari oksidasi kompleks 1 dan 2 oleh ^tBuOOH disajikan ke data spektrum IR.

Gambar 2. Titrasi dari [Mn(Phimp)₂] (1) dengan ^tBuOOH. Spektrum diukur setelah penambahan berurutan 5 µL (0,1 M) ^tBuOOH ke 10 µL dari 5,5 x 10^-4 M [Mn(Phimp)₂] (1) dalam 1 ml DMF pada suhu 25⁰C.

Gambar 3. (a) Oksidasi untuk konversi dari kompleks 3 ke kation kompleks 4 oleh pengulangan 10 µL dari 2,87x10^-3 mM dari [Mn(N–Phimp)₂] oleh dichloromethane (1 ml) dan berganti pada pola spektral yang diukur dengan interval minimum 0,6.

(b) Titrasi dari [Mn(N–Phimp)2] oleh 5 µL dari konsentrasi 3,25x10^-3 mM dengan 0.2 µL ^tBuOOH (0,01 M) dan perubahan terjadi pada pola spektral yang diukur dengan interval minimum 1 dalam 1ml DMF dengan suhu 25⁰C.

3.3. Deskripsi Struktur

Untuk memperoleh struktur baru dari ligan, kristal tunggal dari ligan PhimpH ditumbuhkan secara perlahan-lahan dengan cara evaporasi dari larutan diklorometana. Struktur molekular dari PhimpH dijelaskan oleh Difraksi tunggal Sinar-X. Struktur kristal pada C=N jarak ikatan dari 1.283 (3 ) Å yang mendekati nilai dari 1.282 (3) Å.

Struktur molekul kompleks mangan [Mn(Phimp)₂] (1) dan [Mn(Phimp)₂](ClO₄) (2) dijelaskan pada gambar 3 dan 4.

Gambar 4. Struktur kristal dari [Mn(Phimp)₂] (1), atom menyatakan sebagai lapisan dengan diameter yang berubah-ubah dan garis molekul terletak pada dua kali lipat sumbu x (axis) dari pusat simetri.

Gambar 5. Struktur kristal dari [Mn(Phimp)₂](ClO₄) (2), atom menyatakan sebagai lapisan dengan diameter yang berubah-ubah.

Semua parameter kristalografi disusun pada Tabel 1 dan pemilihan jarak ikatan dan sudut ikatan terdapat pada Tabel 2.

Tabel 1

Data kristalografi untuk kompleks [Mn(Phimp)₂] (1) dan [Mn(Phimp)₂](ClO₄) (2).

Tabel 2

Dipilih jarak ikatan (Å) dan sudut (⁰) pada pusat mangan untuk [Mn(Phimp)₂] (1) dan [Mn(Phimp)₂](ClO₄) (2). Pada kompleks 1 garis molekul tarletak pada dua kali lipat sumbu x (axis) dari pusat simetri. Pada kompleks 1 dan kompleks 2 struktur molekular yang lengkap dapat dikembangkan lebih lanjut.

Kristal dari kompleks 1 diperoleh dari difusi dietileter ke suatu larutan dari kompleks 1 dalam camputran diklorometana:metanol (1:1). Senyawa pada kompleks 1 dikristalisasi pada kelompok monoklin C2/c yang terdiri dari kompleks netral mangan (II) mononuklir pada donor N₄O₂.

Pada kompleks 1 garis molekul terletak pada dua kali lipat sumbu x (axis) dari pusat simetri dan struktur molekular yang lengkap dapat dikembangkan lebih lanjut. Ligan PhimpH merupakan ligan yang terkoordinasi ke ion pusat mangan pada kompleks 1 dan kompleks 2. Pada kedua kompleks 1 dan kompleks 2, pusat logamnya terkoordinasi oleh dua trans nitrogen imina, dua cis nitrogen piridin, dan dua donor cis phenolato posisi oktahedral yang terdistorsi. Pada kompleks 1, jarak Mn–N_py dalah sebesar 2.255 (2) Å. Dengan cara yang sama Mn–O_phenolato (2. 0405 (18) Å) jarak ikatannya lebih pendek daripada struktur [Mn^IIL](ClO₄) (jarak Mn–O_phenolato adalah 2.078 (5) Å, dimana L adalah ligan heptadentat) dan ion [Mn(pyo₃tren)]²⁺ (jarak Mn–O_phenolato adalah 2. 192 (3) Å, dimana pyo₃tren juga merupakan ligan heptadentat). Jarak Mn–N_imina adalah 2.2984 (17) Å juga berhubungan erat dengan data sebelumnya. Koordinasi MnN₄O₂ memperlihatkan suatu distorsi akibat kekakuan ligan sehingga sudut pada pusat logam [N2–Mn–N2; 153.94(9)⁰, O1–Mn–N1; 100.9(3)⁰, O1–Mn–N1; 151.24(6)⁰ (diperlihatkan pada Tabel 2) yang menunjukkan penyimpangan pada posisi oktahedral yang ideal.

Kompleks [Mn(Phimp)₂](ClO₄), dikristalisasi setelah proses penguapan secara perlahan-lahan dari suatu larutan pada kompleks 2 dalam acetonitril dietileter. Proses kristalisasi tersebut berlangsung pada kelompok trigonal P3₁21. Distorsi sempurna pada geometri oktahedral dilakukan oleh N2–Mn1–N1 dari 74.96 (12)⁰, N1–Mn1–N1; 166.57 (16)⁰ (diperlihatkan pada Tabel 2) yang mempunyai perbedaan secara signifikan dari sudut ideal 90⁰ dan 180⁰. Pada kompleks 2, jarak Mn–N_py dan Mn–O_phenolato jarak konsisten dengan data sebelumnya. Jarak ikatan Mn–N_imina sebesar 2.176(3)Å lebih panjang dibandingkan nilai umum dari 2.001(6)Å pada [Mn^III(L)Cl]⁺ dimana L adalah ligan dasar Schiff dan yang lainnya merupakan struktur kompleks mangan (III). Konfigurasi d⁴ dari mangan (III) merupakan system yang alami untuk distorsi Jahn–Teller dan diharapkan dapat memperlihatkan perpanjangan dari ikatan trans. Pada kompleks trans imina ikatannya lebih panjang dibandingkan jarak umum sehubungan dengan distorsi Jahn–Teller.

Pengujian diagram dari kompleks 1 dan kompleks 2 merupakan interaksi non kovalen. Tipe non kovalen dan interaksi ikatan hidrogen pada suatu kompleks sangat berperan pada kristal dan kerangka supramolekuler. Data untuk interaksi non kovalen dapat diperlihatkan di Tabel 3.

Ada atau tidak adanya konjugasi diantara cincin piridin dan cincin phenolato menunjukkan bahwa terdapat kesamaan pada ligan sebagai kompleks logam. Sudut diantara cincin fenil ke nitrogen mengandung cincin phenolato dan cincin piridin yaitu sebesar 88,14⁰ untuk ligan, 86,38⁰ untuk kompleks 1 dan 87,84⁰ untuk kompleks 2 (cincin fenil vs mer naik plane). Perbandingan struktur dari ligan bebas dan ikatan ligan ke pusat logam menunjukkan fakta yang dapat diamati. Perubahan kecil dalam sudut N1–C8–N2 dan O1–C1–C6 dari suatu ligan dapat diamati pada kompleks 1 dan kompleks 2. Pada sisi lainnya sehubungan dengan koordinasi dari nitrogen imina ke pusat logam pada kedua kompleks, sudut N3–C7–C6 dari ligan mengalami penurunan sekitar 7⁰. Panjang ikatan Mn–N_py, Mn–O_phenolato dan Mn–N_imina pada kompleks 2 lebih rendah daripada kompleks 1 yang menunjukkan kemantapan dari pusat mangan (II) untuk kompleks 1 dan pusat mangan (III) untuk kompleks 2. Hal tersebut telah sesuai dengan data momen magnet.

3.4. Hak Milik Redox dan Aktivitas Lapisan Tanah Teratas (SOD)

Untuk menguji pengaruh dari sintesis ligan pada pusat logam, kita dapat menyelidiki elektrokimia dari kelima kompleks yang telah diisolasi dan dikarakterisasi pada percobaan ini. Voltammograms dari kompleks 1 dan 5 diperlihatkan pada Gambar 5 (untuk kompleks 2, 3, dan 4 diperlihatkan pada Keterangan Pendukung Keterangan (Gambar S21)), dan potensial redoks untuk semua kompleks dapat diperlihatkan pada Tabel 3.

Gambar 6. Voltammogram siklis dari suatu larutan 10^-3 M pada kompleks 1 dalam diklorometana dan kompleks 5 pada asetonitril untuk pembuatan 0.1 M tetrabutilammonium perklorat (TBAP), menggunakan elektroda karbon kaca, elektroda Ag/AgCl, dan elektroda pelengkap: platina, dengan laju 0.1 V/s.

Tabel 3

Data elektrokimia untuk pasangan redoks Mn (II)/Mn (III) dan Mn (III)/Mn (IV) pada suhu298 K vs Ag/AgCl.

Ligan netral non kompleks tidak memperlihatkan voltammogram siklis pada rentang 1,0 sampai 1,4V sehingga semua kurva ditujukan untuk aktivitas redoks dari suatu kompleks. Bentuk voltammogram siklis untuk semua kompleks hampir sama dengan dua puncak redoks. Untuk kompleks 1 dapat mencapai puncak dengan cara reversible (dapat balik) dimana kompleks 2 menunjukkan puncak kebalikannya. Untuk kompleks 3 dan kompleks 4 puncak redoksnya dapat dibalik dimana kedua pasangan redoks dapat dibalik di kompleks 5. Dari data (Tabel 3), menunjukkan bahwa satu elektron dilibatkan pada proses redoks tersebut. Gelombang yang dideteksi pada 0.14 sampai 0.40V vs Ag/AgCl telah dipertimbangkan sebagai satu elektron pada proses redoks menuju ke oksidasi [Mn^IIL₂] ke [Mn^IIIL₂]⁺ (dimana L=Phimp^-, N–Phimp^-, Me–Phimp^-) yang menandai pasangan redoks Mn(II)/Mn(III). Gelombang redoks lainnya dapat terdeteksi pada E_1/2=0. 80–1. 06V vs Ag/AgCl yang dideskripsikan sebagai pasangan redoks Mn(III)/Mn(IV). Nilai E_1/2 untuk pasangan Mn(II)/Mn(III) dan Mn(III)/Mn(IV) pada kompleks 5 berturut-turut sebesar 0,143V dan 0,802V. Data tersebut untuk kompleks 5 secara komparatif lebih kecil dibandingkan dengan kompleks lainnya (Tabel 3), hal tersebut dapat dikarenakan adanya donor elektron (–Me) ke ligan.

Superoksida dismutase merupakan salah satu contoh proses redoks sehingga elektrokimia dari kompleks mangan sangat penting untuk Study Aktivitas SOD. Data elektrokimia menunjukkan bahwa pasangan Mn(II)/Mn(III) bertanggung jawab terhadap aktivitas katalitis pada jangkauan yang sesuai. Hal tersebut dapat member kesempatan pada kita untuk mempelajari aktivitas SOD dari kompleks yang ada. Nilai IC₅₀ untuk aktivitas SOD didefinisikan sebagai konsentrasi dari sebagian senyawa untuk 50% larangan dari reduksi NBT oleh superoksida yang dihasilkan pada sistem oksidasi xanthine/xanthine. Data IC₅₀ dari uji aktivitas SOD dapat dilihat pada Tabel 4 dan kurva larangan untuk kompleks 1 diperlihatkan pada Gambar 7.

Tabel 4

Nilai IC₅₀ untuk tiap-tiap konstanta kinetik pada kompleks 1, 2,4, dan 5.

Gambar 7. Aktivitas SOD untuk kompleks 1 (dalam DMF) pada uji oksidasi xanthine-nitro blue tetrazolium (NBT).

Berdasarkan data yang diperoleh, untuk kompleks 2 menunjukkan nilai IC₅₀ paling rendah, sedangkan untuk kompleks 4 menunjukkan nilai IC₅₀ yang paling tinggi. Jika data IC₅₀ dibandingkan untuk semua kompleks Mn (III), kompleks 2 menunjukkan nilai yang paling rendah dan kompleks 4 menunjukkan nilai IC50 yang paling tinggi. Kompleks 1 dan 2 memanfaatkan redoks Mn (II)/Mn (III) yang sama untuk menghancurkan ion superoksida. Kompleks 1 (untuk kedudukan oksidasi +2) mengubah ke sedangkan Mn lain yaitu kompleks Mn(III) mengubah ke menggunakan pasangan redoks yang sama. Sehubungan dengan ketidakstabilan kompeks 3 di udara maka kompleks tersebut tidak dapat diuji aktivitasnya. Bagaimanapun nilai IC₅₀ untuk kompleks 1 dan 2 (berturut-turut 0. 29 μM dan 0.39 μM) tidak hanya menunjukkan nilai yang terbaik diantara kompleks-kompleks mangan yang lain tapi juga menunjukkan sifat yang mirip SOD.

3.5 Studi pengikatan DNA

Untuk menguji aktivitas nuklease dari semua kompleks ini maka dilakukan penelitian yaitu pertama menguji interaksi DNA dengan molekul kecil SOD. Diantara semua kompleks, kompleks 2 dipilih untuk syudi interaksi DNA sehubungan dengan daya larutnya di larutan buffer biologis. Kompleks lain tidak dapat larut sehingga tidak dapat digunakan untuk uji studi pengikatan DNA. Untuk memperjelas pengikatan DNA pada kompleks 2 maka digunakan 2 teknik pengukuran aktivitas yaitu studi spektrum UV–visible dan fuoresensi EB. Hasil percobaan diperlihatkan berturut-turut pada Gambar 8 dan Gambar 9

Gambar 8. (a) Spektrum serapan dari [Mn(Phimp)₂] (ClO₄), 2 dalam 0.1 mM buffer fosfat (pH 7.2) yang terbentuk seiring dengan peningkatan jumah dari DNA( [DNA] = μM 0–68).

(b ) Plot dari [DNA] (εA- εF) vs. [DNA]

Intensitas mencapai puncak pada 307 nm pada spektrum UV–visible kemudian menurun sehubungan dengan penambahan dari CT-DNA. Sebuah hypochromicity yang mungkin dari 4.41% tanpa perubahan pada panjang gelombang menyiratkan bahwa beberapa interaksi terjadi di antara kompleks 2 dengan permukaan dan berinteraksi dengan molekul DNA bukan interkalasi. Kuat ikatan dari kompleks 2 dengan CT-DNA dapat menjadi ekspresi dalam kaitannya dengan konstanta ikatan K_b, dimana mewakili konstanta ikatan per pasangan basa DNA. Konstanta ini dapat diperoleh dari pengamatan perubahan pada absorbansi pada satu λ_maks dengan peningkatan pada konsentrasi CT-DNA dengan menggunakan persamaan:

[DNA]/(ε_A – ε_F)= [DNA]/(ε_B – ε_F)+ 1/Kb (ε_B - ε_gm)

dimana [DNA] merupakan konsentrasi dari DNA pada pasangan basa dan ε_A,ε_p, dan ε_B sesuai dengan rasio dari A_abs/[kompleks], berturut-turut yaitu absorptivitas molar untuk kompleks mangan bebas dan absorptivitas molar untuk kompleks mangan pada sepenuhnya pembentuk ikatan. Pada plot dari [DNA]/(ε_A – ε_F) vs. [DNA], K_b diberikan oleh rasio dari slop kemiringan ke Y-intersep. Konstanta ikatan K_b ditemukan agar untuk menjadi 7.87 10⁴ M^-1 dimana lebih rendah dibandingkan nilai yang dilaporkan pada interkalasi dari kompleks mangan. Pengujian studi spektral fluoresensi dilakukan ke kemungkinan selanjutnya dari model interkalasi ikatan. EB merupakan sebuah interkalator yang memberikan sebuah peningkatan signifikan pada pemancaran fluoresensi ketika berikatan dengan DNA, dan geserannya dari DNA menghasilkan pada satu penyusutan intensitas fluorecensi. Penambahan dari kompleks 2 ke sistem EB-DNA menunjukkan perubahan yang sangat kecil pada fluoresensi (diperlihatkan pada Gambar 9).

Gambar 9. Emisi spektrum fluoresensi dari sistem EB-CT-DNA ([DNA] = 25μM) dalam absensi (garis penghancur) dan presensi (garis padat) dari kompleks 2 (0–7μM)

Nilai Kb yang lebih rendah dan perubahan kecil pada spektrum fluoresensi menunjukkan interaksi ikatan non-interkalasi dengan DNA dan memungkinkan ikatan alur atau keterikatan eksternal yang disarankan. Struktur larutan untuk kompleks 2 juga mengungkap bahwa cincin fenil menyerang nitrogen secara tegak lurus (87.84^o) ke ikatan ligan yang mempunyai cincin fenolato dan cincin piridin. Cincin fenil ini mungkin menghalangi interkalasi dengan DNA.

3.6 Aktivitas Nuklease

Studi absorpsi dan fluoresensi dengan kompleks 2 menunjukkan interaksi non-interkalasi dari kompleks mangan dengan CT-DNA. Selanjutnya yaitu mempelajari studi interaksi DNA dengan menguji aktivitas nuklease dari kompleks. Perpecahan dari supercoiled pBR322 DNA oleh kompleks dipelajari menggunakan gel elektroforesis dalam buffer tris. Pengujian aktivitas nuklease dilakukan pada 10% DMF untuk kompleks 1, 2 dan 4. Dampar scissions dari plasmid pBR322 diuji keberadaan H₂O₂-nya. Pengujian data yang peroleh dari gel elektroforesis DNA itu telah jelas menunjukkan bahwa H₂O₂ pada kompleks dapat membelah plasmid pBR322 DNA untuk satu campuran dari supercoiled dan menoreh DNA (diperlihatkan pada gambar 9).

Gambar 10. Hasil pemisahan menggunakan gel elektroforesis

Pada pencarian mekanisme dari aktivitas nuklease kompleks-kompleks ini diteliti juga aktivitas dari NaN₃ dan KI dimana telah diketahui membentuk oksigen singlet dan radikal hidroksil. Tidak ada perubahan pada aktivitas nuklease dari NaN₃ dan inhibitor dari aktivitas KI yang diamati. Data ini menunjukkan perannya dengan jenis oksigen reaktif (ROS) yang dilibatkan dalam aktivitas nuklease.

IV. KESIMPULAN

Sintesis dan karakterisasi spektroskopi kompleks Mn dengan ligan tridentate (PhimpH, N-PhimpH, dan Me-PhimpH) menghasilkan lima senyawa kompleks baru yaitu [Mn(Phimp)₂], [Mn(Phimp)₂ClO₄], [Mn(N-Phimp)₂], [Mn(N-Phimp)₂ClO₄], dan [Mn(Me-Phimp)₂ClO₄] sebagai senyawa tiruan SOD. Struktur molekul kristalografi sinar X dari 2 kompleks (1 dan 2) menunjukkan pembentukkan Mn (II) dan Mn(III) dengan pusat logam terikat secara meridional. Analisis sifat elektrokimia menunjukkan Mn(II)/Mn(III) dan Mn(III)/Mn(IV) merupakan pasangan redoks yang memenuhi syarat sebagai molekul kecil tiruan SOD. Nilai IC50 untuk 2 kompleks ini (0,29 dan 0,39) menunjukkan aktivitas kompleks dalam menghambat reduksi NBT oleh superoksida. Studi DNA interaksi dengan memeriksa aktivitas nuklease pada DMF 10% dari kompleks dilakukan untuk kompleks 1, 2 dan 4. Berdasarkan data yang diperoleh jelas bahwa H₂O₂ dapat dipecah oleh kompleks ligan baru dalam campuran superkoil plasmid DNA pBR322 seperti halnya aktivitas SOD dalam memecah H₂O₂ dalam tubuh.

DAFTAR PUSTAKA

Ghosh, Kaushik et al., 2010, Stabilization of Mn(II) and Mn(III) in mononuclear complexes derived from tridentate ligands with N₂O donors: Synthesis, crystal structure, superoxide dismutase activity and DNA interaction studies, Journal of Inorganic Biochemistry 104 (2010) 9–18.